線性范圍的評估及數(shù)據(jù)處理方法

實(shí)驗(yàn)樣本的基本要求和制備方法

基本要求

樣本基質(zhì)應(yīng)與臨床實(shí)驗(yàn)樣本相似，但不可采用含有對測定方法具有明確干擾作用物質(zhì)的樣本，如溶血、脂血、黃疸或含有某些特定藥物的樣本。進(jìn)行血清學(xué)標(biāo)志物檢測時(shí)，理想的樣本為分析物濃度接近預(yù)期測定上限的混合人血清。

建立一種定量測定方法的線性范圍時(shí)，需在預(yù)期測定范圍內(nèi)選擇7-11個(gè)濃度水平。如將預(yù)期測定范圍加寬至130%，在此范圍內(nèi)選擇更多的濃度水平，然后依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果逐漸減少數(shù)據(jù)點(diǎn)直至表現(xiàn)出線性關(guān)系，可發(fā)現(xiàn)最寬的線性范圍。

當(dāng)對標(biāo)稱線性參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，需在已知線性范圍內(nèi)選擇5-7個(gè)濃度水平。

無論是建立或驗(yàn)證線性范圍，所選用的濃度水平應(yīng)可覆蓋整個(gè)預(yù)期測定范圍并包括與臨床有關(guān)的重要評價(jià)濃度，如最小測定濃度或線性范圍的最低限、不同的醫(yī)學(xué)決定水平、最大測定濃度或線性范圍的高限等。

制備方法

不同濃度水平的樣本可通過將高濃度樣本與低濃度樣本進(jìn)行倍比稀釋得到，注意在進(jìn)行液體吸取時(shí)應(yīng)選擇精密度與準(zhǔn)確性好的移液裝置。制備時(shí)應(yīng)將樣本完全混合并避免蒸發(fā)或其他使樣本變質(zhì)的情況。每份樣本的濃度與體積單位應(yīng)統(tǒng)一。

如果高/低濃度血清的值未知，可將每種血清編碼，用編碼代表每個(gè)血清的相對濃度。對于等濃度間隔樣本，可用連續(xù)整數(shù)（如1、2、3、4、5）代表連續(xù)樣本。進(jìn)行數(shù)據(jù)處理時(shí)可用樣本號(hào)代替X值。表1和表2中描述的樣本制備過程是按照等濃度間隔的設(shè)計(jì)進(jìn)行的，每個(gè)濃度水平的樣本量為1.00ml。

表1：11個(gè)濃度水平的樣本制備

表2：5個(gè)濃度水平的樣本制備

制備非等濃度間隔的樣本時(shí)應(yīng)明確各樣本間的濃度關(guān)系，測定時(shí)可以這些樣本間的相對濃度比值做為X值。

樣本的特殊處理：在無法得到適用的人血清時(shí)，需對樣本進(jìn)行一些特殊處理以滿足實(shí)驗(yàn)要求。這些處理過程包括稀釋、加入添加物或透析、熱處理等，無論進(jìn)行何種處理均應(yīng)以保持基質(zhì)恒定為基本原則。在評價(jià)報(bào)告中應(yīng)對所使用的稀釋液、添加物、溶劑等的材料來源加以注明。

樣本稀釋液應(yīng)選用由廠家推薦或經(jīng)實(shí)驗(yàn)室證明可使用的產(chǎn)品，如可采用5%牛血清白蛋白或人白蛋白溶液。欲提高樣本濃度時(shí)可在樣本中添加分析物純品。在添加物為溶液狀態(tài)時(shí)，應(yīng)注意添加液體對樣本的稀釋作用（小于10%）并注明所用溶劑。

實(shí)驗(yàn)過程

1. 建立線性范圍：需測定9-11個(gè)濃度水平，每個(gè)濃度水平重復(fù)測定3-4次。
2. 驗(yàn)證標(biāo)稱線性參數(shù)：需測定4-6個(gè)濃度水平，每個(gè)濃度水平重復(fù)測定3-4次。
3. 所有樣本應(yīng)在一次運(yùn)行中或幾次間隔很短的運(yùn)行中隨機(jī)測定，最好在一天之內(nèi)完成。

數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)記錄

可參考下表進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄,也可采用其它形式進(jìn)行記錄，但應(yīng)注意保留原始數(shù)據(jù)。

數(shù)據(jù)可用性檢查

可通過繪制散點(diǎn)圖對測定數(shù)據(jù)的可用性進(jìn)行初步檢查。以樣本號(hào)或樣本濃度為X軸，以測定結(jié)果為Y軸做圖，在圖上標(biāo)出針對每個(gè)樣本的測定值及每個(gè)濃度水平的測定均值，手工或用計(jì)算機(jī)做圖將均值點(diǎn)相連，觀察數(shù)據(jù)點(diǎn)與直線間的偏差，如偏差過大，表明數(shù)據(jù)組存在明顯非線性，需要對測定過程進(jìn)行檢查，排除因操作錯(cuò)誤所至誤差，并對樣本進(jìn)行重新測定。如圖形與直線接近，表明可對數(shù)據(jù)組繼續(xù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

剔除離群值

離群值可由散點(diǎn)圖初步判斷，標(biāo)準(zhǔn)中建議采用格拉布斯（GRUBBS）法進(jìn)行離群值檢驗(yàn)。檢驗(yàn)步驟如下：

• 1. 每組數(shù)據(jù)中有4個(gè)測定結(jié)果，分別記為 y1，y2，y3，y4。
• 2. 將4個(gè)測定值按大小順序排列，最大值記為max，最小值記為 min;
• 3. 由4個(gè)測定值計(jì)算均值y和標(biāo)準(zhǔn)差S：
  y=(y1+y2+y3+y4)/4；
• 4. 根據(jù)可疑值 max或 min分別按下式計(jì)算統(tǒng)計(jì)量t：
  t1 = (max-)/S，t2 = (min-)/S;
• 5. 根據(jù)給定的顯著性水平a和重復(fù)測定次數(shù)查表得臨界值，如t值大于臨界值，則相應(yīng)的可疑值為離群值。

進(jìn)行多項(xiàng)回歸分析

對數(shù)據(jù)組進(jìn)行多項(xiàng)回歸分析，得到一級(jí)、二級(jí)與三級(jí)多項(xiàng)式。一級(jí)多項(xiàng)式為直線，二級(jí)多項(xiàng)式表示上升曲線或下降曲線，三級(jí)多項(xiàng)式表示S形曲線（在測量范圍兩端具有明顯的非線性）。多項(xiàng)式方程如下：

對回歸方程進(jìn)行線性檢驗(yàn)

多元回歸方程中以bi表示的系數(shù)為回歸系數(shù)。在二級(jí)與三級(jí)方程中，b2與b3為非線性系數(shù)。對回歸方程進(jìn)行線性檢驗(yàn)就是對每個(gè)非線性系數(shù)作t檢驗(yàn)，判斷回歸系數(shù)與零是否有顯著性差異。b0與b1不反映非線性，故不需對其進(jìn)行檢驗(yàn)。對b2與b3的檢驗(yàn)方法如下：

計(jì)算統(tǒng)計(jì)量t，計(jì)算公式為：
t = b_i/ SE_i
式中SE_i 為每個(gè)非線性系數(shù)的斜率標(biāo)準(zhǔn)誤，計(jì)算公式為：
；；
；
其中，Y為回歸方程預(yù)測值，與與為測定均值。

由公式df = L*R-Rdf 計(jì)算自由度，L為樣本數(shù)，R為每個(gè)樣本的測定次數(shù)，Rdf為回歸自由度，即回歸方程中系數(shù)（包括b0）的個(gè)數(shù)。如測定5樣本，每個(gè)樣本重復(fù)測定4次，則對測定數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析后其三級(jí)多項(xiàng)式中L=5，R=4，Rdf=4，df=5*4-4=16。在t值表中尋找t界值（雙邊檢驗(yàn)，α=0.05），將計(jì)算出的t值與界值比較，如p>0.05，表示非線性系數(shù)與零無顯著性差異，數(shù)據(jù)組被認(rèn)為具線性，此時(shí)可對數(shù)據(jù)組進(jìn)行精密度檢驗(yàn)，具體方法見后。當(dāng)精密度符合線性判斷要求時(shí)，數(shù)據(jù)分析可結(jié)束。如p<0.05，表示此非線性系數(shù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，數(shù)據(jù)組為非線性，此時(shí)應(yīng)進(jìn)行臨床標(biāo)準(zhǔn)的線性與非線性檢驗(yàn)。

臨床標(biāo)準(zhǔn)的線性與非線性檢驗(yàn)

上述多項(xiàng)式回歸分析主要是利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行線性判斷，統(tǒng)計(jì)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的線性可稱為一階線性，對數(shù)據(jù)組的要求很高。對于在臨床實(shí)驗(yàn)室中使用的測定方法，在其臨床應(yīng)用實(shí)踐中允許有一定的非線性誤差，此時(shí)通過對統(tǒng)計(jì)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的非線性作程度判斷，可得到臨床標(biāo)準(zhǔn)的線性，即二階線性。

臨床標(biāo)準(zhǔn)的線性檢驗(yàn)中使用了兩個(gè)統(tǒng)計(jì)量，ADL（偏離直線平均差異，average deviation from linearity）與PctBnd（百分區(qū)界 ，percent bound） ，對于大多數(shù)分析物PctBnd取5%。如ADL小于所要求的臨界判斷值，則可認(rèn)為數(shù)據(jù)組具有臨床可接受的線性，所擬合出的最適非線性多項(xiàng)式無臨床意義。

ADL值的計(jì)算：

ADL表示最優(yōu)擬合曲線與直線的平均差異，其計(jì)算公式如下：

式中p(x)表示最優(yōu)擬合二階或三階方程的擬合值，a+bx表示擬合一階方程的擬合值，L表示樣本數(shù)，c表示總平均濃度（全部測量數(shù)據(jù)的平均值）。

將ADL與臨界值比較

一般設(shè)定ADL小于5%為臨床允許誤差，即取PctBnd為5%，通過查表（見附表A與B）得到ADL臨界值。如ADL小于臨界值，可認(rèn)為多項(xiàng)式具有臨床可接受的非線性，為二階線性。如ADL大于臨界值，則為臨床不可接受的非線性。

對數(shù)據(jù)組進(jìn)行精密度檢驗(yàn)

測量數(shù)據(jù)的精密度可直接影響多項(xiàng)式回歸分析的結(jié)果，為提高統(tǒng)計(jì)功效，需對數(shù)據(jù)組進(jìn)行精密度檢驗(yàn)。

計(jì)算最優(yōu)擬合方程的回歸標(biāo)準(zhǔn)誤（σ）

式中yi表示各個(gè)測量值，p(xi)表示最優(yōu)擬合方程的擬合值，n表示樣本數(shù)乘以重復(fù)次數(shù)(L x R)，d表示最優(yōu)擬合方程的階數(shù)。

計(jì)算不精密度

用最優(yōu)擬合方程的回歸標(biāo)準(zhǔn)誤（σ）與總平均濃度()的百分比代表不精密度。

數(shù)據(jù)組的不精密度檢驗(yàn)

跟據(jù)以下公式進(jìn)行判斷：

式中σ表示最優(yōu)擬合方程的回歸標(biāo)準(zhǔn)誤，表示總平均濃度，L表示樣本數(shù)，R表示重復(fù)測量的次數(shù)，C表示常數(shù)(附表C)，PctBnd：取5%。

不精密度滿足判斷式時(shí)， 說明數(shù)據(jù)的精密度好可作線性評價(jià)。反之則表示數(shù)據(jù)的精密度差，不能作線性評價(jià)。當(dāng)PctBnd取5%時(shí)， 尚可通過查不精密度和臨界值表判斷數(shù)據(jù)是否精密 (附表A和B)， 如此時(shí)不精密度對應(yīng)的臨界值顯示P， 表明測量數(shù)據(jù)的精密度不符合作線性判斷的要求。

結(jié)果報(bào)告

線性范圍報(bào)告的具體格式不要求，但至少應(yīng)包括以下幾方面：

進(jìn)行線性評價(jià)的實(shí)驗(yàn)室或生產(chǎn)廠家名稱。

被評價(jià)的方法或試劑名稱，批號(hào)。

測定項(xiàng)目。

線性范圍（如為二階線性應(yīng)包括臨床允許誤差）。

如可能應(yīng)標(biāo)出測定項(xiàng)目的醫(yī)學(xué)決定水平及在此水平處的臨床允許誤差。

附錄：

表A：不精密度和ADL的臨界值（PctBnd=5%，d=1或2階）

L*R：樣本數(shù)*重復(fù)測量的次數(shù)

表B：不精密度和ADL的臨界值（PctBnd=5%，d=3階）

L*R：樣本數(shù)*重復(fù)測量的次數(shù)

表C：不精密度界值的常數(shù)

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• PG1
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